ИННОВАЦИИ БИЗНЕСУ

Номер

53-008-06

Наименование проекта

Способы стерилизации растительного материала косточковых культур для культивирования in vitro

Назначение

Для повышения эффективности стерилизации растительного материала

Рекомендуемая область применения

Сельскохозяйственное растениеводство

Описание

«Описание к ИЛ №53-008-06»

Результат выполнения научно-исследовательской работы.

Введение

Подготовка растительного материала к введению в культуру in virto является важным этапом работы. Особое внимание следует уделять стерилизации объектов, т.к. поверхностные ткани растения могут быть заражены бактериями, грибами и их спорами.

Выбор стерилизующего агента должен удовлетворять основным требованиям: нейтрализация микрофлоры и сохранение тканей от повреждений. Исходя из этого, стерилизующее вещество должно не проникать в растительные ткани или обладать способностью легко разрушаться и выводиться из них, иметь достаточную экспозицию. Выбор стерилизующего вещества и времени стерилизации также зависит от чувствительности тканей.

В практике микроклонального размножения косточковых культур используют следующие стерилизаторы, систематизированные по эффективности [1]:

1.            Гипохлорид кальция (9-10% раствор, 5-30 мин, эффективность хорошая, удаляется легко);

2.            Гипохлорид натрия (2% раствор, 5-30 мин, эффективность хорошая, удаляется легко);

3.            Перекись водорода (10-12% раствор, 5-15 мин, эффективность хорошая, удаляется легко);

4.            Бромная вода (1-2% раствор, 2-10 мин, эффективность хорошая удаляется легко);

5.            Нитрат серебра (0,8-1%, 5-30 мин, эффективность хорошая, удаляется трудно);

6.            Сулема (0,1% раствор, 2-10 мин, эффективность хорошая, удаляется плохо);

7.            70% этанол (1-2 мин, удаляется хорошо, используется как предварительный стерилизатор);

8.            Диацит (этанолмеркурихлорид и борная кислота с цетилпиридинбромидом в качестве детергента – 0,1% раствор, 2-10 мин, эффективность хорошая, удаляется хорошо);

Также используют 1% дихлорамин в экспозиции 10 минут [2, 3]. Применение в качестве стерилизующих агентов гипохлорида кальция и натрия для вишни показало их слабую эффективность (апексы оставались заражены микрофлорой,  при повышении концентрации раствора – погибали) [4]. Многие исследователи применяют мыльный раствор, 1% диоксидин [5], 0,1% раствор сулемы или 0,01% - мертиолата [6, 7], 0,02-0,2% бенлат, 0,8-0,4% физан [7], 0,7-7% раствор «Доместоса» [8].

Методика и результаты исследования

В лаборатории биотехнологии  ГОУ ВПО «ОГУ» была оптимизирована стандартная методика стерилизации растительного материала в период с 1998 по 2002 годы совместно с Джигадло М.И. Нами был исключен этап промвки под проточной водой. В качестве стерилизующего агента использовался 70% этанол в экспозиции 3-4 с., затем промывали исходный материал 4 минуты автоклавированной бидистиллированной водой, далее подвергали его обработке сулемой 4 мин, дважды промывали автоклавированной бидистиллированной водой по 2 мин. В итоге затраты времени снизились с 50-60 мин, до 12 мин. Инфицированные экспланты косточковых культур составляли 1-2% [9]. В дальнейшем время промывки растительных объектов после этанола было сокращено до 2 минут.

В ходе работы приходится сталкиваться со сложностью приобретения стерилизующих веществ, токсичностью при работе с ними.

Целью работы являлось исследование эффективности некоторых стерилизующих веществ   при работе с растительными объектами косточковых культур на этапе введения в культуру in vitro.

Объекты исследований: апикальные и латеральные почки, свободные от кроющих чешуй, срезанные на щиток районированных в Орловской области сортов вишни, черешни, сливы и отдаленных видов подсемейства Prunoideae, а также зеленые черенки некоторых сортов вишни и черешни в летний период.

Оценивали эффективность следующих стерилизующих веществ в системе оптимизированной схемы стерилизации косточковых культур:

Нитрат серебра 1% раствор в экспозиции 1 мин, 1мин 30с, 2 мин, 2мин 30с, 3 мин. при стерилизации почек; 3, 4, 5 мин при стерилизации зеленых черенков (сравнительно малое время экспозиции выбрано с учетом токсичности препарата);

Бытовой препарат «Fаiry», в экспозиции 1 мин, 2 мин, 3 мин, 4 мин, 5мин, 6 мин.

Перекись водорода 3%, в экспозиции 15 мин, 20 мин (выбрано в связи с тем, что обычно используется концентрация в 3-4 раза выше испытуемой в экспозиции 5-15 минут).

Учитывали инфицированность объектов и их жизнеспособность.

В летний период методом зеленых микрочеренков в культуру вводили сорта вишни Жуковская, Стойкая, Новелла, Ровесница, Антрацитовая, Мценская, Студенческая и черешни Поэзия, Аделина. Зеленые черенки стерилизовали 1% нитратом серебра в экспозиции 3, 4, 5 минут. Во всех вариантах отмечен ожег тканей и дальнейшая гибель эксплантов.

В зимний период методом меристем в культуру вводились сорта вишни Мценская, Ливенская, Долгожданная, Ровесница, Тургеневка, Неполодская, Муза, Стойкая, Трофимовская, Шоколадница, Памяти Вавилова, Превосходная Колесниковой, 21885, Орлея, Студенческая, Любская, черешни Фея, Поэзия, Аделина, Сюбаровская, сливы Калифорнийская, Рекорд, Неженка, Краса Орловщины, Орловский Сувенир, вишня степная, сахалинская.

Стерилизации 1% нитратом серебра подверглись почки сортов вишни Мценская, Ливенская, Тургеневка, Превосходная Колесниковой, Любская в экспозициях 1 мин, 1мин 30с, 2 мин, 2мин 30с, 3 мин. Инфицированные экспланты отсутствовали. Отмечена 100% жизнеспособность эксплантов на всех вариантах, кроме последнего. При дальнейшем культивировании эксплантов на питательных средах наблюдался замедленный рост меристематической ткани в вариантах с экспозицией стерилизующим раствором азотнокислого серебра от 1 мин 30 с до 3 мин. Экспланты имели серовато-зеленую окраску, слабое развитие, что, вероятно, свидетельствует о повреждении растительных тканей.  Данный стерилизатор не в полной мере удовлетворяет предъявляемым к нему требованиям.

Препаратом «Feiry» стерилизовали почки сортов вишни Мценская, Ливенская, Долгожданная, Ровесница, Тургеневка, Неполодская, Любская, 21885, черешни Фея, Поэзия, сливы Калифорнийская, Рекорд, Неженка и некоторых отдаленных видов. При стерилизации бытовым препаратом «Fаiry», в экспозициях 1 мин, 2 мин, 3 мин, 4 мин, 5 мин, 6 мин, было определено оптимальное время воздействия им на исходный растительный материал – 5 мин. Капля препарата растворялась в 60-70 мл автоклавированной бидистиллированной воды. Последующая промывка стерильной водой длилась до удаления пены от препарата – 10-15 минут.

Общее число введенных в культуру in vitro меристематических тканей составляло 675 шт., инфицированные объекты – 2,67%. Дальнейшие наблюдения показали нормальное развитие эксплантов.

Сорта вишни Муза, Стойкая, Трофимовская, Шоколадница, Памяти Вавилова, Превосходная Колесниковой, Ровесница, Студенческая, Орлея, черешни Аделина, Сюбаровская, сливы Краса Орловщины, Орловский Сувенир и отдаленных видов стерилизовали 3% перекисью водорода 15 минут. Всего в культуру было введено 511 меристем, инфицированных объектов – 2,54%. 

В течение 20 минут стерилизовали сорта вишни Муза, Стойкая, Трофимовская. Инфицированность объектов была близка к результатам, полученным при 15 минутной экспозиции – 2,52% (при общем числе введеных эксплантов – 119 шт.). Поэтому для оптимизации данного этапа было выбрано минимальное время обработки этим препаратом. Промывка исходного материала  от стерилизатора проводилась автоклавированной бидистиллированной водой дважды по 2 минуты.

Дальнейшее развитие эксплантов на питательных средах, оптимальных для каждого вида косточковых культур, было достаточно выровненным, без видимых отклонений от нормы в пределах сорта.

Выводы

Эффективность стерилизации исходного растительного материала водным раствором бытового препарата «Fаiry» в экспозиции 5 мин и  3% перекисью водорода - 15 минут близка по значению – процент инфицирования составил 2,67% и 2,54% соответственно.

Стерилизация 3% перекисью водорода занимает больше времени по сравнению с воздействием препарата «Fаiry», но перекись водорода «отмывается» относительно легко – достаточно 2-х кратной промывки автоклавированной бидистиллированной водой, а промывку объектов от препарата «Fаiry» необходимо проводить сравнительно долго с затратой большого количества воды. В итоге, время, затрачиваемое на весь процесс, отличается незначительно (табл. 1).

Учитывая все преимущества и недостатки испытанных стерилизующих агентов, можно сделать вывод, что наиболее оптимальными и удобными в применении, доступными и малотоксичными являются водный раствор бытового препарата «Fаiry» и 3% раствор перекиси водорода. Важными достоинствами являются хорошая нейтрализация микрофлоры и сохранение тканей от повреждений.

Таблица 1

 Схема стерилизации растительных объектов

Преимущества перед известными аналогами

Повышение эффективности стерилизации растительного материала

Стадия освоения

Внедрено в производство

Результаты испытаний

Технология обеспечивает получение стабильных результатов

Технико-экономический эффект

Технология обеспечивает получение стабильных результатов

Возможность передачи за рубеж

Возможна передача за рубеж

Дата поступления материала

10.03.2006