ИННОВАЦИИ БИЗНЕСУ

Результат выполнения научно-исследовательской работы.

Принцип метода основан на осаждении из цельной крови при помощи этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) эритроцитов и выделении центрифугированием эритроцитарной массы. После двукратной отмывки эритроцитов изотоническим раствором натрия хлорида, из них с помощью изопропанол-гексана экстрагируют липиды и последовательно определяют содержание общих липидов, холестерина и продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Ход определения

Берут цельную кровь, в качестве консерванта используют ЭДТА натрия (0,5 мл 1%-го раствора ЭДТА на 5 мл венозной крови). После цетрифугирования при 2000 об/мин в течение 8 мин и отделения плазмы, полученную эритроцитарную массу трижды отмывают двукратным объемом изотонического раствора хлорида натрия с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течение 7 мин. Затем эритроцитарную массу разводят изотоническим раствором натрия хлорида в 2 раза.

Для экстракции липидов берут 1 мл эритроцитарной массы, приливают 3 мл изопропанола, перемешивают стеклянной палочкой, встряхивают в течение 15 мин, затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. Добавляют 3 мл гексана, вновь тщательно перемешивают стеклянной палочкой, встряхивают в течение 15 мин и оставляют отстаиваться на 30 мин. После разделения слоев, верхний (изопропанол-гексановый слой) отбирают в сухую пробирку и используют для исследований.

Определение общих липидов проводят по реакции с фосфорно-ванилиновым реактивом. К 0,2 мл экстракта прибавляют 1,5 мл концентрированной серной кислоты и гидролизуют в течение 15 мин на кипящей водяной бане. После охлаждения проб проточной водой, берут 0,1 мл гидролизата и прибавляют 1,5 мл фосфорно-ванилинового реактива (в контрольную пробу вместо гидролизата берут 0,1 мл концентрированной серной кислоты). Тщательно перемешивают, выдерживают пробы при комнатной температуре в течение 50 мин. Оптическую плотность пробы (А ₁) и эталонного раствора (А ₂) измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 510-550 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм против контрольного раствора.

Расчет проводят по формуле

Общие липиды (г/л) = 8 Ч А ₁/А ₂,

где: 8 - концентрация стандартного раствора липидов в г/л.

Расчет также можно проводить по калибровочному графику.

Определение холестерина

К 0,05 мл изопропанол-гексанового экстракта прибавляют 2 мл цветного реактива, содержимое тщательно перемешивают и оставляют в термостате при температуре +60­ ⁰С в течение 15 мин, затем пробирки охлаждают до комнатной температуры и определяют экстинкцию на фотоэлектроколориметре в кюветах с рабочей длиной 5 мм при длине волны 560 нм против цветного реактива. Параллельно аналогичным образом обрабатывают стандартный раствор содержащий 1-2 ммоль/л холестерина.

Расчет проводят по калибровочной кривой.

Определение продуктов ПОЛ

Первичные продукты ПОЛ: диеновые конъюгаты определяют спектрофотометрически при длине волны 233 нм и кетодиены и сопряженные триены - при длине волны 278 нм.

Спектрофотометрия изопропанол-гексанового экстракта при длине волны 220 нм позволяет судить о содержании ненасыщенных липидов.

Рассчитывают содержание диеновых конъюгатов, кетодиенов и сопряженных триенов по отношению к уровню ненасыщенных липидов (Е ₂₃₃/Е ₂₂₀ и Е ₂₇₈/Е ₂₂₀).

Малоновый диальдегид (МДА) - конечный продукт ПОЛ определяют колориметрически. В центрифужную пробирку вносят 0,3 мл экстракта, 0,3 мл 1%-й ортофосфорной кислоты, 0,1 мл 0,6%-го раствора 2-тиобарбитуровой кислоты и 0,1 мл раствора сульфата железа, ставят в кипящую водяную баню на 1 ч. Пробы охлаждают проточной водой, добавляют 4 мл бутанола, тщательно перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Измеряют на спектрофотометре СФ-46 оптическую плотность верхней фазы при длине волны 535 нм против бутанола (Е _оп).

Содержание МДА рассчитывают по формуле

МДА (мкмоль/л) = Е _оп^. 10 ⁶ : 4/К ^. 0,3,

где: 4 - объем бутанольной фазы;

0,3 - объем экстракта, взятый для анализа;

К - коэффициент молярной экстинкции триметинового комплекса МДА, равный

1,56 ^.10 ⁵ моль/см.

Количественные сдвиги в содержании тотальных липидов, холестерина и продуктов ПОЛ в мембранах эритроцитов позволяют судить о состоянии мембран внутренних органов и могут характеризовать заболевания печени, почек, легких и других органов у животных. Поэтому определение предложенных биохимических показателей в конечном итоге направлено на сохранение здоровья и поголовья высокопродуктивного стада животных.