ИННОВАЦИИ БИЗНЕСУ

Результат выполнения научно-исследовательской работы.

Исследование содержания гидроксипролина в биологических жидкостях позво-ляет судить о метаболизме фибриллярного белка соединительной ткани - коллагена, в состав которого входит указанная аминокислота. Существующие биохимические методы позволяют определять суммарный гидроксипролин.

Предлагается метод выделения коллагена из сыворотки крови осаждением трихлоруксусной и хлорной кислотами с последующим центрифугированием. В надосадочной жидкости определяют свободный и пептидносвязанный гидроксипролин.

Принцип метода. Гидроксипролин подвергают окислению хлорамином Б, затем продукты его окисления конденсируют с пара-диметилбензальдегидом, при этом образуется хромоген красного цвета.

Приборы: спектрофотометр, центрифуга, водяная баня.

Реактивы: 1. 8,5 М хлорная кислота.

2. 0,3 М трихлоруксусная кислота.

3. 3,1 М раствор фенолфталеина в 16,1 М этаноле.

4. 6 М раствор натрия гидроксида.

5. 0,26 М раствор хлорамина Б в 0,1 М фосфатном буфере, рН 8,0.

6. 0,67 М раствор пара-диметиламинобензальдегида в 16,1 М этаноле.

7. Водные растворы, содержащие 1, 5, 10 и 20 мкг гидроксипролина в 4 мл.

8. Активированный уголь.

Ход определения.

В центрифужную пробирку вносят 2 мл сыворотки крови, 1 мл трихлоруксусной кислоты и 1 мл хлорной кислоты, перемешивают и спустя 5 мин центрифугируют при З000 об/мин в течение 5-6 мин.

Надосадочную жидкость количественно переносят в другую мерную центрифужную пробирку, замеряют объем. Осадок сохраняют для последующего определения белковосвязанного гидроксипролина. Ровно половину надосадочной жидкости переносят в другую центрифужную пробирку, в этой пробе определяют свободный гидроксипролин. Для этого нейтрализуют 24%-ным раствором натрия гидроксида в присутствии индикатора спиртового раствора фенолфталеина, добиваясь появления устойчивой слабопурпурной окраски (при завершении нейтрализации реактив натрия гидроксид лучше добавлять на кончике стеклянной палочки).

Во второй половине надосадочной жидкости, предназначенной для определения пептидносвязанного гидроксипролина, пробирку закрывают специальным каплеуловителем (или центрифужной пробиркой, заполненной холодной водой) и гидролизуют в кипящей водяной бане в течение 40 мин, охлаждают проточной водопроводной водой до 18-22 ^оС и нейтрализуют как указано выше.

К осадку добавляют 1 мл дистиллированной воды, 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты и 1 мл хлорной кислоты. Смесь закрывают каплеуловителем и гидролизуют в кипящей водяной бане в течение 6 час. К охлажденной проточной водопроводной водой до температуры 18-22 ^оС смеси добавляют 0,2-0,4 г активированного угля, встряхивают и центрифугируют 5-6 мин при 3000 об/мин. Прозрачную часть гидролизата нейтрализуют раствором натрия гидроксида как указано выше.

Параллельно готовят контрольную пробу, которая содержит 4 мл дистиллированной воды. Для определения гидроксипролина во все пробирки добавляют по 1 мл хлорамина Б. Содержимое тщательно перемешивают встряхиванием при комнатной температуре в течение 20 мин. Затем приливают по 1 мл хлорной кислоты, содержимое перемешивают 5 мин, приливают по 1 мл пара-диметилбензальдегида. Смесь тщательно перемешивают многократным встряхиванием и помещают в водяную баню при температуре 60 ^оС на 20 мин. Затем пробирки охлаждают проточной водопроводной водой. Измеряют оптическую плотность супернатанта (после центрифугирования в течение 15 мин при 3000 об/мин) на спектрофотометре при длине волны 557 нм против контроля. Окраска устойчива в течение 1 часа.

Содержимое свободного гидроксипролина (1-я пробирка), пептидно-связанного (2-я пробирка) и белково-связанного (3-я пробирка) гидроксипролина рассчитывают по калибровочной кривой и выражают в микромолях на 1 л сыворотки крови.

Увеличение концентрации суммарного гидроксипролина в биологических жидкостях свидетельствует об интенсификации обмена коллагена, что наблюдается при деструктивных и воспалительных процессах в соединительной ткани. Увеличение концентрации свободного гидроксипролина отражает степень распада коллагена, что наиболее выражено в первые этапы патологического процесса, протекающего в соединительной ткани. Содержание пептидно-связанного и белково-связанного гидроксипролина более выраженно повышается при интенсификации фибриллогенеза.

Следовательно, измерение концентрации свободного, пептидно- и белково-связанного гидроксипролина в биологических жидкостях имеет значение для диагностики заболеваний соединительной ткани, поэтому предлагаемый способ позволяет улучшить диагностику возможных заболеваний у животных, что в конечном итоге имеет значение для сохранения здоровья и поголовья высокопродуктивного стада.