ИННОВАЦИИ БИЗНЕСУ

Результат выполнения научно-исследовательской работы.

Принцип способа основан на том, что липопротеины низкой плотности (ЛПНП) осаждаются гепарином в присутствии солей марганца и затем удаляются центрифу-гированием. В растворе остаются липопротеины высокой плотности (ЛПВП). В раз-деленных фракциях липопротеинов последовательно определяют продуктыпере-кисного окисления липидов ПОЛ и содержание тотальных липидов, триацилглице-ринов и холестерина.

Исследование проводят следующим образом. В центрифужную пробирку вносят 1 мл исследуемой сыворотки крови или плазмы, добавляют 0,04 мл гепарина (концентрация в 1 мл 5000 ЕД), тщательно перемешивают стеклянной палочкой и добавляют 0,05 мл 1М раствора хлорида марганца, после повторного тщательного перемешивания пробы ставятна 30 мин в морозильную камеру. Затем пробы оттаи-вают и центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об/мин (желательно при темпе-ратуре 4-6 ^оС). Пробирки из центрифуги необходимо вынимать осторожно, чтобы не взмутить осадок. Нижний слой содержит осажденные ЛПНП, верхний - растворенные ЛПВП, над которым может плавать еще кольцо хиломикронов. Пипеткой с тонким носиком осторожно отсасывают слой, содержащий ЛПВП. В разделенных фракциях ЛПНП и ЛПВП последовательно определяют продукты ПОЛ, тотальные липиды, триацилглицерины и холестерин.

Определение продуктов ПОЛ. В центрифужные пробирки вносят 0,3 мл ра-створа ЛПНП или ЛПВП, 0,3 мл 1%-й ортофосфорной кислоты, 0,1 мл 0,6%-го раствора 2-тиобарбитуровой кислоты и 0,1 мл раствора сульфата железа. Пробирки ставят в кипящую водяную баню на 1 ч. Затем пробы охлаждают проточной водой, до-бавляют 4 мл бутанола, тщательно перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Измеряют на спектрофотометре СФ-46 оптическую плотность верх-ней фазы при длине волны 535 нм против бутанола (Еоп.).

Содержание малонового диальдегида (МДА) -конечного продукта ПОЛ, рас-считывают по формуле

МДА = ЕопЧ10 ⁶Ч4/КЧ0,3,

где: МДА-содержание в мкмоль/л или нмоль/л,

4-объем бутанольной фазы,

0,3-объем липопротеиновой фракции для анализа,

К-коэффициент молярной экстинкции триметинового комплекса малонового диальдегида = 1,56Ч10⁵моль/см.

Определение тотальных липидов проводят по реакции с сульфофосфовани-линовым реактивом. К 0,02 мл растворенного осадка липопротеинов низкой плотности или надосадочной жидкости липопротеинов высокой плотности прибавляют1,5 мл концентрированной серной кислоты и кипятят в течение 15 мин на кипящей водяной бане. После охлаждения проточной водой берут 0,1 мл гидролизата и прибавляют 1,5 мл фосфорно-ванилинового реактива (в контрольную пробу вместо гидролизата берут 0,1 мл концентрированной серной кислоты). Тщательно перемешивают, выдерживают пробы при комнатной температуре в течение 50 мин. Оптическую плотность пробы (А1) и стандартного раствора (А2) измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 515 нм в кювете толщиной слоя 10 мм против контроля.

Расчет производят по формуле

тотальные липиды (г/л) = 8ЧА1/А2,

где: 8-концентрация стандартного раствора липидов, г/л.

Определение содержания триацилглицеринов проводятпосле экстрагирова-ния из липопротеиновых фракций. Освобожденный в результате щелочного гидролиза глицерол окисляют до формальдегида с помощью метаперйодата натрия. Образовав-шийся формальдегид дает с ацетилацетоном 3,5-диацетил-1,4-дигидролутидин, интен-сивность окраски которого пропорциональна содержанию триацилглицеринов.

Ход определения. К 0,5 мл раствора липопротеиновых фракций добавляют 2,0 мл гептана, 3,5 мл изопропилового спирта и 1,0 мл раствора серной кислоты. Содержимое пробирки тщательно перемешивают в продолжение 20 с оставляют стоять в течение 5 мин и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин.

К 0,4 мл верхнего слоя жидкости приливают 2,0 мл изопропилового спирта и 1 каплю КОН. Содержимое пробирки перемешивают на протяжении 15 с. Пробирку закры-вают пробкой и нагревают на водяной бане в течение 10 мин при 70 ^оС.Послеее охлаждения добавляют по 0,2 мл перйодатного и 1,0 мл ацетилоацетонового реак-тивов, содержимое пробирки смешивают, закрывают ее пробкой и вновь нагревают в течение 10 мин на водяной бане при 70 ^оС, после чего измеряют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре при длине волны 410-430 нм в кювете с шириной слоя 5 мм. Результаты сравнивают с аналогичными данными контрольной пробы.

Контрольную пробу ставят так же, как и опытную, но вместо липопротеинов берут 0,5 мл дистиллированной воды.

Стандартную пробуставяттак же, как опытную, но вместо липопротеинов используют 0,5 мл калибровочного раствора.

Расчет производят по формуле

Соп (ммоль/л) = Аоп : АстЧ2,3,

где: 2,3-концентрация триацилглицеринов в стандартном растворе (ммоль/л).

Определение холестерина липопротеинов осуществляют следующим образом. К 0,1 мл образца растворенного осадка ЛПНП или надосадка ЛПВП добавляют 2,0 мл цветного реактива, содержимое хорошо перемешивают и выдерживают пробы в термостате при температуре 60 ^оС в течение 15 мин, затем пробирки охлаждают до комнатнойтемпературы и определяют на фотоэлектроколориметре экстинкцию в кювете с рабочей длиной 5 мм при длине волны 560 нм против цветного реактива.

Расчет проводят по калибровочной кривой с раствором, содержащим 1-2 ммоль/л холестерина.

Определение продуктов ПОЛ и липидного состава липопротеинов низкой и высокой плотности может указать на возможные заболевания у животных, что в конечном итоге направлено на сохранение здоровья высокопродуктивного стада.