ИННОВАЦИИ БИЗНЕСУ

Результат выполнения научно-исследовательской работы.

Окислительный этап пентозофосфатного (апотомического) пути обмена угле-водов играет важную роль в организме животных и человека, поскольку обеспечивает образование пентозофосфатов, необходимых для биосинтеза нуклеотидфосфатов и нуклеиновых кислот, а также восстановленной формы никотинамидадениндинуклео-тидфосфата (НАДФН.Н+), используемого на эндогенные реакции гидрирования.

Принцип способа заключается в запуске первой глюкозо-6-фосфатдегидро-геназной реакции и определении активности данного фермента общепринятым мето-дом. Затем пробы инкубируют в течение 1 часа при температуре 37 ^оС. После останов-ки реакции прибавлением раствора трихлоруксусной кислоты измеряют активность транскетолазы. Таким образом, реакция протекает за счет эндогенных продуктов мета-болизма без внесения извне субстрата - рибозо-5-фосфата.

Исследование проводят следующим образом: к 2,4 мл 0,05 трис-НСl буфера, рН 7,5, прибавляют 0,5 мл биологической жидкости (сыворотки, плазмы, околоплодной жидкости, можно также внести 5%-й гомогенат ткани в количестве 0,1 мл), 0,05 мл раствора НАДФ+ и инкубируют в термостате при температуре 25 ^оС в течение 10 мин. Затем содержимое пробирки переносят в кювету и прибавляют 0,05 мл раствора глюкозо-6-фосфата и последовательно измеряют экстинкцию при длине волны 366 нм на спектрофотометре СФ-46 через каждые 2 мин в течение 10 мин. Оптическая плотность не должна возрастать более чем на 0,030 в 1 мин, в случае необходимости образец следует развести. В контрольную кювету вместо НАДФ+ вносят буферный раствор, остальные реактивы те же, что и в опыте. При расчете активности из результатов опытной пробы вычитают результаты контрольной. Указанным способом измеряют ферментативную активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.49) и вычисляют по формуле

А = Е/1,39Ч10³,

где: А - активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы,

Е - экстинкция при длине волны 366 нм,

1,39 Ч 10 ³ - коэффициент миллимолярной экстинкции восстановленного НАДФН 2 при 366 нм.

Активность выражают в мкмоль НАДФН 2/ (л.ч) или в мкмоль НАДФН 2/ мг белка за 1 ч.

После измерения глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной активности в контрольной пробирке реакцию останавливают прибавлением 1 мл 10%-й трихлоруксусной кислоты (ТХУ). В опытной пробе содержимое переносят в центрифужную пробирку и инку-бируют ее в ультратермостате при температуре 37 ^оС в течение 60 мин. Затем ре- акцию останавливают прибавлением 1 мл 10%-й ТХУ, пробы выдерживают 10 мин в холодильнике при 4 ^оС и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин, сливают прозрачную надосадочную жидкость, в которой в дальнейшем определяют активность транскетолазы (КФ 2.2.1.1.) по реакции взаимодействия рибозо-5-фосфата с орцино-вым реактивом. С этой целью к 0,1 мл надосадочной жидкости прибавляют 0,9 мл дистиллированной воды и 2 мл орцинового реактива, кипятят в течение 15 мин. Затем измеряют экстинкцию развившейся окраски на фотоэлектроколориметре при красном светофильтре (540 нм) в кюветах с рабочей длиной 5,0 мм.

Расчет рибозы проводят по калибровочному графику. По разности экстинкции контрольной и опытной проб судят об активности транскетолазы. Активность фермен-та выражают в мкмоль рибозы на 1 л за 1 ч или в мкмоль рибозы на 1 мг белка за 1 ч.

Таким образом, предложенный способ позволяет определить активность фер-ментов пентозофосфатного пути окисления углеводов без внесения дополнительных субстратов (6-фосфоглюконолактона и рибозо-5-фосфата).

Способ позволяет диагностировать заболевания животных, связанные с нару-шением биосинтеза нуклеиновых кислот и липидов, в том числе, и наследственные болезни, что способствует оздоровлению высокопродуктивного племенного стада крупного рогатого скота.