ИННОВАЦИИ БИЗНЕСУ

Результат выполнения научно-исследовательской работы.

Фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаза (КФ 4.1.2.13) - фермент гликолитического распадаглюкозы обратимо расщепляет d-фруктозо-1,6-бисфосфат на две молекулы триозофосфата: глицеральдегид-3-фосфат (ГАФ) и дигидроксиацетонфосфат (ДАФ)

l-фруктозо-1,6-бисфосфат«ГАФ + ДАФ.

Принцип способа основан на том, что фруктозо-бисфосфатаза расщепляет добавленный d-фруктозо-1,6-бисфосфат на ГАФ и ДАФ. При отщеплении лабильного фосфора свободные триозы фиксируются 2,4-динитрофенилгидразином, образуя гид-розоны, окрашенные в щелочной среде. Интенсивность окраски прямо пропорци-ональна активности фруктозо-бисфосфатазы.

В химически чистые пробирки вносят 1,8 мл инкубационной среды, содер-жащей 50 ммоль трис-НСl буфера, рН 7,4; 6 ммоль фруктозо-1,6-бисфосфата натрия или калия, 56 ммоль гидразинсульфата, 0,2 ммоль монойодуксусной кислоты и ставят на 10 мин в водяной ультратермостат при температуре 37 ^оС. В пробирку, которая будет служить контролем, прибавляют 2 мл 10%-гораствора холодной трихлор-уксусной кислоты. Через 10 мин в контрольные и опытные пробы вносят 0,2 мл сыворотки крови. Пробы инкубируют 60 мин при температуре 37^оС. После инкубации реакцию в опытных пробах останавливают прибавлением 2 мл 10%-го раствора холодной трихлоруксусной кислоты. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и центрифугируют. К 1 мл центрифугата прибавляют 1 мл 0,75 н. раствора натрия гидроксида и оставляют стоять на 10 мин при комнатной температуре. По истечении этого срока добавляют 1 мл 0,1%-го раствора 2,4-динитрофенилгидразина и смесь нагревают в течение 10 мин при температуре 37 ^оС на водяной бане. Затем доводят раствором 0,75 н. натрия гидроксида объем до 5-10 мл (в зависимости от интенсивности окрашивания) и через 20мин колориметрируют на фотоэлектроколо-риметре при длине волны 540 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм против холостого опыта.

Параллельно проводят определение белка биуретовым методом.

Расчет проводят по калибровочному графику, построенный по дигидроксиа-цетону.

Активность фруктозо-бисфосфатазы выражают в мкмолях фруктозо-1,6 бис-фосфата на 1 мг белка за 1 час инкубации.

Измерение активности сывороточной фруктозо-бисфосфатазы имеет значение для диагностики злокачественных новообразований, а также повышенная активность характерна для заболеваний печени, поэтому предлагаемый способ позволяет улучшить диагностику возможных заболеваний у животных, что в конечном итоге имеет значение для сохранения здоровья и поголовья высокопродуктивного стада.