ИННОВАЦИИ БИЗНЕСУ

Недостаточность витамина Е в организме приводит к многочисленным клинически не проявляющимся нарушениям структуры и функций различных органов и их систем. В нашей лаборатории были предприняты серьезные попытки по применению супердоз витамина Е в производственных условиях с целью повышения сохранности при ранних сроках отъема поросят. В условиях производства эти попытки оказались не эффективными. Однако, выяснилось, что в случае супердозирования витамином Е повышается концентрация алльфа-токоферола в плазме. Но поскольку этот показатель не является функциональным тестом, то мы использовали метод спонтанного гемолиза эритроцитов для выяснения вопроса - в какой мере защита эритроцитарных мембран альфа-токоферолом связана с его связана с его окислением в альфа-токоферилхинон.

С этой целью в условиях вивария ВНИИФБиП был проведен опыт на помесных поросятах (крупно-белая х крупно-черная х дюрок). В опыте участвовало три группы животных по 4 головы в каждой. Поросята контрольной (i)группы в соответствии с возрастным периодом получали полнорационный комбикорм СК-5 при фоне природного альфа-токоферола СК-5, равном 17,27 мг/кг корма. В комбикорм поросятiiгруппы добавляли 294 мг альфа-токоферилацетата на 1 кг корма,iiiгруппы - 56 мг альфа-токоферилхинона на 1 кг корма (по данным непосредственного анализа). Для оценки Е-витаминного состояния организма через 18 суток с момента начала опыта у животных были взяты пробы крови.

При анализе использовали метод спонтанного гемолиза эритроцитов. В центрифужную пробирку помещали 2 капли крови, добавляли 3 мл соле-фосфатного буфера и центрифугировали 10 минут при 2000 об./мин. Надосадочную жидкость удаляли. К осадку добавляли 3 мл соле-фосфатного буфера. Затем все перемешивали до получения однородной суспензии и по 1 мл взвеси клеток помещали в каждую из двух пробирок. В одну добавляли 4 мл соле-фосфатного буфера, в другую - 4 мл дистиллированной воды. Пробирки инкубировали при температуре 37 ⁰С в течение 4-х часов. Затем их охлаждали при комнатной температуре и вновь центрифугировали 10 минут при 2000 об./мин. Определение оптической плотности надосадочной жидкости проводили на спектрофотометре при длине волны 415 нм. Расчет вели по формуле:

100 % гемолиза = А/Б х 100 %,

где А - оптическая плотность раствора в пробирке 1, Б - в пробирке 2.

Результаты исследований (см. таблицу) показывают, что степень спонтанного гемолиза эритроцитов уменьшалась у животных, получавших повышенную дозу витамина (Р=0,04) и практически не изменилась в случае добавок альфа-токоферилхинона в рацион. Следует отметить, что по сравнению с контролем концентрация альфа-токоферола в эритроцитах в связи в добавками альфа-токоферилацетата, и особенно альфа-токоферихинона, была меньше. В добавок к этому, корреляционный анализ показал, что с увеличением гемолиза концентрация альфа-токоферилхинона в эритроцитах поросят уменьшается (=-0,74). Отсутствие влияния добавок экзогенного альфа-токоферилхинона на степень спонтанного гемолиза и наличие обратной связи этой величины с концентрацией альфа-токоферилхинона в эритроцитах позволяет говорить о том, что в спонтанном гемолизе важен сам факт окисления альфа-токоферола в альфа-токоферилхинон и последний накапливается, не играя при этом никакой роли в стабилизации мембран.

Однако, тест спонтанного гемолиза эритроцитов лишен специфичности. Он показывает положительные результаты не только при низких концентрациях витамина Е в плазме, но и при анемиях различной этиологии с нормальными сывороточными уровнями токофрола. В связи с этим приемлемо использование гемолиза в качестве теста на обеспеченность организма токоферолом лишь в комбинации с другими методами оценки.

Таблица

Влияние добавок альфа-токоферилацетата и альфа-токоферилхинона

на степень гемолиза эритроцитов, а также концентрацию

альфа-токоферола (а-ТН) и альфа-токоферилхинона (а-ТХ) в эритроцитах

Группа	Гемолиз, %	а-ТН	а-ТХ	а-ТХ / а-ТН
i	1,42±0,22	0,24±0,02	0,22±0,03	0,97±0,02
ii	0,58±019	0,19±0,04	0,37±0,12	2,27±1,02
iii	1,31±012	0,12±0,01	0,14±0,02	1,25±0,34

Поскольку защита эритроцитарных мембран альфа-токоферолом напрямую связана с его окисленим в альфа-токоферилхинон и последний накапливается, то его определение в данном биологическом субстрате может служить надежным критерием уровня обеспеченности организма витамином Е. В результате нашей работы разработан простой способ определения альфа-токоферилхинона в эритроцитах. В его основе лежит экстракция липидов с последующим определением УФ-спектра поглощения. Для анализа брали 10 мл эритроцитов, добавляли 90 мл ацетона. Перемешав смесь стеклянной палочкой, оставляли ее на ночь при комнатной температуре. Утром смесь фильтровали. Фильтрат упаривали, растворяли в 3 мл гексана и измеряли поглощение УФ-света при 276 нм против воздуха. Затем перерастворяли экстракт в 3 мл этанола и измеряли поглощение при 276 нм против воздуха. разность поглощения между этанольным и гексановым раствором пробы использовали для определения альфа-токоферилхинона ( Е 1% , 1 см = 140). Расчет вели по формуле: ,

где С - концентрация альфа-токоферилхинона, мкг (мл),

А - разность оптической плотности между этанольным и гексановым раствором альфа-токоферилхинона при 276 нм.

Нормальному уровню обеспеченности организма поросят витамином Е соответствует 0,17 - 0,28 мкг альфа-токоферилхинона в 1 мл эритроцитов.

Таким образом, полученные результаты исследований свидетельствуют, что защита эритроцитарных мембран от перекисного окисления альфа-токоферолом напрямую связана с его окислением в альфа-токоферилхинон. В этой связи определение последнего в эритроцитах является более надежным критерием, чем величина спонтанного гемолиза, уровня обеспеченности поросят витамином Е. Для повышения устойчивости эритроцитарных мембран к окислению в условиях стресса на основании наших результатов исследований и данных лаборатории витаминного питания ВНИИФБиП с.-х. животных рекомендуется добавлять в рацион животных 250 мг альфа-токоферилацетата на 1 кг корма.